СТАТТЯ: Д-ДИМЕР ЯК МАРКЕР ТРОМБОУТВОРЕННЯ ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ В КЛІНІЧНІЙ ПРАКТИЦІ

Лабораторний тест для визначення Д-димера за частотою вимірювань є одним із найзатребуваніших досліджень у практичному дослідженні системи згортання крові. Він займає четверте місце за кількістю призначень після протромбінового часу (ПЧ), активованого часткового тромбопластинового часу (АЧТЧ) та фібриногену. З моменту відкриття Д-димера (1970-і роки) і початку його застосування в клінічній практиці (1990-і роки) аналіз крові на Д-димер міцно увійшов до арсеналу часто використовуваних тестів лікарями багатьох спеціальностей для діагностики захворювань, пов'язаних з патологічним тромбоутворенням.

Д-димер є кінцевим продуктом такого процесу, що відбувається в організмі людини як фібриноліз. У 1893 р. термін «фібриноліз» запропонував використовувати французький фізіолог Dastre, а в 1905 р. вчений з Німеччини Morawitz зробив припущення про те, що у фібринолізі беруть участь деякі ферменти. Це було підтверджено доктором Sherry (США) у 1959 р., який довів, що активатором фібринолізу є плазмін, що утворюється з його попередника плазміногену. У 1973 р. одночасно дві дослідні групи повідомили про виявлення унікального фрагмента, отриманого при гідролітичному розщепленні білка фібрину ферментом плазміном в сироватці людини (1). Пізніше цей фрагмент отримав назву Д-димер і його почали використовувати як інструмент для діагностики різних захворювань. Багато клінічних станів характеризуються збільшенням концентрації Д-димеру в плазмі крові. (Табл.1).

Табл.1. Стани, пов'язані з підвищенням рівня Д-димеру

Механізм утворення Д-димер.

В даний час для діагностики тромбозу використовуються продукти розщеплення фібриногену (рис.1). Фібриноген при дії тромбіну утворює мономери фібрину шляхом розщеплення двох невеликих фрагментів (фібринопептидів А та В). Під час цього процесу негативний заряд Е фібриногену (червоні кружечки) перетворюється на позитивний заряд, що дозволяє спонтанно полімеризуватися мономерам фібрину в полімер, який стабілізується водневими зв'язками. Тромбін також активує фактор XIII (фермент трансглутаміназу), який стабілізує вихідний полімер фібрину шляхом каталітичного утворення зшитих ковалентних зв'язків між сусідніми D-доменами (зелені кружечки). Під дією тканинного активатора плазміногену (t-PA), що є сериновою протеазою, з неактивного плазміногену утворюється активний плазмін, який розщеплює фібрин на безліч дрібних фрагментів, які називаються продуктами деградації фібрину (ПДФ). Д-димер, утворений із двох суміжних зшитих мономерів, є одним з основних ПДФ. На відміну від кінцевих продуктів розщеплення фібриногену, які представлені у вигляді окремих фрагментів D і Е, при розщепленні поперечно-зшитих фактором ХIIIа волокон фібрину, утворюються більші фрагменти - D-димери, тримери D-E-D, оскільки плазмін не здатний розщеплювати ковалентний зв'язок

                                                                      Рис.1. Механізм утворення Д-димера

Таким чином, дія фібринолітичної системи спрямована на лізис фібрину, а при надмірній активації фібриногену. У результаті утворюється суміш продуктів деградації фібрину/фібриногену. Продукти деградації фібрину – це великі фрагменти Д-димери та тримери, а продукти деградації фібриногену – окремі олігопептиди з невеликою молекулярною масою. Тільки продукти деградації поперечно-зшитого фібрину містять Д -Димери. При цьому діє правило:

Д-димер відноситься як до маркерів активації згортання та фібриноутворення, так і до маркерів активації фібринолізу. Період напівжиття Д-димеру становить приблизно 8 годин, кліренс здійснюється через нирки та ретикуло-ендотеліальну систему. Визначення D-димеру є найбільш поширеним лабораторним маркером активації згортання та фібринолізу.

Методи визначення Д-димеру.

1. Якісні та напівкількісні методи:

- реакція аглютинації латексних частинок (плазма);

2. Кількісні:

- імунохроматографія;

- Point-of-Care (діагностика за місцем лікування).

- ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay; фермент-зв'язаний імуносорбентний метод);

- імунодифузія на пористих мембранах;

- Імунотурбідиметрія.

Коротка характеристика методів.

1. Методи визначення Д-димеру, засновані на латексній аглютинації.

До плазми, що містить Д-димер, додають латексні кульки, покриті моноклональними антитілами проти Д-димеру та відзначають час появи макроскопічної аглютинації на предметному склі. Це не дорогі та легко здійснювані дослідження. Вони мають помірну чутливість, але більш високу специфічність по відношенню до тромбозу глибоких вен (ТГВ) та тромбоемболії легеневої артерії (ТЕЛА).

2. Метод імунохроматографії.

Відносна нечутливість тестів латексної аглютинації призвела до розробки більш чутливих тестів, заснованих на імунохроматогрифічній експрес-діагностиці. Цей метод поєднує у собі швидкість проведення дослідження (від 2 хв) з високою чутливістю. Відзначено особливу цінність імунохроматографічного методу при визначенні ТГВ.

3. Метод ELISA.

ELISA методи дослідження Д-димер мають високу чутливість, але відносно низьку специфічність. Низька специфічність цих методів обумовлює у значному числі випадків помилково позитивні результати. Метод полягає у додаванні до лунок мікропланшетів, покритих антитілами до Д-димеру досліджуваної плазми. Після інкубації вносять мічені ферментом антитіла і після зупинки реакції проводять колориметричний вимір. Цей метод є трудомістким та займає багато часу для його проведення, а також потребує спеціального обладнання. Дані обставини роблять його не практичним для рутинного використання у клінічній практиці.

4. Імунодифузія на пористих мембранах.

За останні роки було розроблено імуноферментні методи визначення Д-димеру, які дозволяють отримувати результат протягом 10 хвилин. Вони використовують пористі мембрани, покриті антитілами, які захоплюють Д-димер. Плазму хворого фільтрують через мембрану і потім до фільтрату додають мічені антитіла, щоб визначити зв'язаний Д-димер.

5. Імунотурбідиметрія.

Одним з варіантів латексного методу визначення Д-димер є метод мікро-латексної аглютинації або імунотурбідиметричний метод. При додаванні плазми пацієнта, що містить Д-димер до реагента, відбувається збільшення оптичної густини розчину, яка прямо пропорційна концентрації Д-димеру у досліджуваному зразку. Комерційні набори визначення Д-димера розроблені для автоматичних аналізаторів (біохімічних і коагулометрів), що дозволяє виконувати дослідження цього аналіту в рутинному режимі.

Два типи одиниць виміру Д-Димера.

1. D-Dimer Units (DDU) - для методів, що використовують очищений Д-Димер як калібратор.

2. Fibrinogen Equivalent Unit (FEU) - фібриноген-еквівалентні одиниці (ФЕО), для методів, що використовують як калібратор ПДФ (продукт деградації фібрину), що утворюються під дією плазміну.

Розмір одиниць вказується виробником тесту (нг/мл, мкг/мл, мкг/л).

Референтні значення Д-димеру.

Порогові значення для Д-Димера в залежності від одиниць вимірювання:

1. DDU ≤ 0,25 мкг/мл (250 нг/мл або 250 мкг/л);

2. FEU ≤ 0,5 мкг/мл (500 нг/мл або 500 мкг/л).

Числові значення легко конвертуються одна в одну, так як маса однієї одиниці FEU дорівнює половині DDU. Наприклад, 0,5 мкг/мл FEU = 0,25 мкг/мл DDU.

Якщо концентрація Д-Димера в плазмі менша від зазначених порогових значень, то наявність тромбозу у пацієнта можна виключити.

Обмеження щодо Д-димера.

Тест на Д-димер являється нестандартизованим маркером. На сьогоднішній день відомо близько 30 комерційних тест-систем для визначення Д-димера між якими спостерігаються певні відмінності, так як кожен виробник встановлює свій власний метод стандартизації.

Основними причинами обмеження методу є:

- використання різних моноклональних антитіл (понад 20), що відрізняються за специфічністю та чутливістю;

- Відсутність Міжнародного Референтного Стандарту (International Reference Preparation);

- Відсутність стандартного калібратора;

- Різні одиниці вимірювання, що використовуються для різних методів.

Відсутність стандартизації різних тест-систем для визначення Д-димера означає, що результати, референтні інтервали і значення cut-off не можуть бути екстрапольовані для різних методів. При кількісному вимірі Д-димера одного й того пацієнта різними тест-системами виходять різні результати, порівнювати які не коректно.

Причини розбіжності у аналізах на Д-Димер.

1. Д-димерний антиген не є гомогенним, а складається з сполук, що містять фрагменти D та Е з різною молекулярною масою (Рис.2.)

2. Під час аналізу Д-димера використовуються різні антитіла, буфери, вимірювальна техніка, стандарти.

                                           Рис.2. Д-димерний антиген, що складається з множини фрагментів D та Е

Така варіабельність у типах і одиницях вимірювання Д-димера призвела до плутанини в деяких лабораторіях, особливо коли необхідно було встановити поріг для виключення венозної тромбоемболії.

Необхідно пам'ятати, що існує 2 різні типи одиниць для Д-димера (Рис.3):

1. Д-димер одиниця – DDU з молекулярною масою 195 кDa;

2. Одиниця еквівалентності фібриногену - FEU з молекулярною масою 340 кDа

                                                   Рис.3. Два типи одиниць вимірювання для Д-димера (DDU та FEU)

Оскільки D-димер виражається в масових одиницях, тип залучених одиниць дуже важливий при встановленні порогу для виключення венозної тромбоемболії та інтерпретації результатів.

Таким чином, методи визначення Д-димера засновані на його взаємодії з моноклональними антитілами до специфічних епітопів в Д-доменах молекул фібрину. Ці специфічні антитіла зв'язуються з Д-димерами, що містять D-D ковалентні зв'язки, але не вступають у реакцію з фібриногеном та розчинними фібрин-мономерами. Д-димери, що виявляються в плазмі - це показник розщеплення фібрину, але не фібриногену і фібрин-мономерів.

Клінічна значущість Д-димера.

Клінічне застосування вимірювання Д-димеру показано для:

- виключення венозної тромбоемболії (ВТЕ);

- діагностиці та моніторингу дисемінованого внутрішньосудинного згортання (ДВЗ);

- Визначенні тривалості антикоагулянтної терапії.

Питання використання Д-димер залишається дискусійним при:

- прогнозі перебігу захворювань серцево-судинної системи;

- прогнозуванні несприятливих наслідків вагітності;

- Додатковій оцінкці ризику тромбоемболії та при інших патологіях.

1. Венозний тромбоемболізм.

Венозний тромбоемболізм є досить частою патологією, який поєднує тромбози глибоких вен і тромбоемболію легеневої артерії. Утворення будь-якого тромбу в судинному руслі завжди призводить до активації фібрнолізу та появи в крові продуктів розпаду фібрину. Чутливість тесту Д-димера у діагностиці венозного тромбоемболізму дуже висока – 90-100%. Цей аналіз може проводитись для підтвердження факту тромбозу. При оцінці результатів дослідження слід враховувати те, що підвищення рівня Д-димеру в крові тільки вказує на утворення фібрину та його лізис, проте в якому відділі судинного русла, в якому обсязі та з якої причини це сталося необхідно вирішувати в кожному конкретному випадку за допомогою клінічних та візуалізаційних методів (доплер-УЗД). Рівень Д-димера при ТЕЛА практично не залежить від локалізації легеневого тромбу. Тест на Д-димер відрізняється високим негативним прогностичним рівнем - 97-100%. Він цінний не так для підтвердження факту тромбозу, скільки для його виключення. Негативний результат аналізу практично завжди свідчить про відсутність тромбів у кровоносному руслі. Тому основною метою дослідження Д-димер є виключення наявності тромбів в судинному руслі при диференціальній діагностиці ТГВ і ТЕЛА.

Є певні обмеження використання Д-димеру при ВТЕ (25-27) (табл.2).

              Табл.2. Обмеження використання тес та Д-димер при ВТЕ

Варто відмітити, що Д-димер може бути негативним при ТЕЛА, якщо згусток давній (2 тижні і більше після утворення тромбу) і якщо згусток дуже маленький. Д-димер може бути хибно підвищеним за наявності високого титру IgM. У разі перевищення порогового значення необхідно підтвердження діагнозу за допомогою доплер-УЗД, спіральної комп'ютерної томографії або контрастної венографії. Ще одним стратегічним підходом для діагностики ВТЕ є попередня оцінка по клініко-анамнестичних оціночних шкалах (шкала Wells) (28-31).

2. Дисеміноване внутрішньосудинне згортання.

Дисеміноване внутрішньосудинне згортання (ДВЗ) - це поширена патологія з високою захворюваністю і смертністю. Характеризується системною активацією системи гемостазу з внутрішньосудинним утворенням фібрину та підвищеним фібринолізом (32,33). Якщо пацієнти не отримують відповідного лікування, то це призводить до виснаження тромбоцитів, факторів згортання та інгібіторів, результатом чого може бути загрозлива для життя кровотеча та/або тромбоз. ДВЗ найбільше поширене у пацієнтів з інфекційними запальними захворюваннями, злоякісними новоутвореннями, травмами або акушерською патологією. Класифікація ДВЗ поділяє цю патологію на несимптоматичну (пре-ДВЗ), органну недостатність, кровотечу та субтипи масивної кровотечі. ISTH (International Society of Thrombosis and Haemostasis) гармонізувало посібник з діагностики та лікування ДВЗ (34,35). Д-димер включений до керівництва ISTH як рекомендований лабораторний тест для оцінки пацієнтів із ДВЗ-синдромом.

3. Антикоагулянтна терапія.

Антикоагулянти непрямої дії.

Після закінчення курсу лікування антикоагулянтами непрямої дії (АНД) у пацієнтів (у тому числі літніх) кількісне визначення рівня Д-димеру дає цінну інформацію для індивідуальної оцінки ризику венозної тромбоемболії. При використанні статистичних методів були визначені залежні від віку рівні cut-off (порогового значення) для Д-димеру щодо ризику ВТЕ, складові при використанні різних тест-систем

- 250-700 мкг/л FEU для пацієнтів віком до 70 років

- 450-1000 мкг/л FEU для пацієнтів старше 70 років (Рис.4).

Рис.4. Зміна концентрації Д-димеру в залежності від віку

Через 30 днів після відміни варфарину нормальний рівень Д-димеру мав дуже високу негативну прогностичну цінність щодо рецидиву ВТЕ, особливо у пацієнтів з вродженою тромбофілією або вперше розвиненим спонтанним тромбозом, а підвищені рівні Д-димеру відповідали вищому ризику. При цьому від'ємний результат тесту на Д-димер через 2 тижні після закінчення 3-х місячного курсу лікування варфарином був пов'язаний з 3,5% ризиком повторного ВТЕ протягом року, а позитивний результат - з ризиком 8,9%. Ці дані свідчать про важливу роль Д-димеру у визначенні оптимальної тривалості курсу лікування АНД для надійного попередження рекурентних венозних тромбозів.

Гепаринотерпія.

Ефективність гепаринотерпії визначається зміною рівня динаміки Д-димеру. Зниження Д-димеру свідчить про правильно підібрану дозу гепарину у пацієнтів з активацією гемостазу будь-якої етіології. Тест також інформативний при лікуванні низькомолекулярними гепаринами. Введення клексану протягом 2-3 тижнів призводить до зниження рівня Д-димеру в 1,5-2 рази, а 10-денне застосування еноксипарину сприяло зниженню рівня цього аналіту на 23%.

4. Серцево-судинна система.

Рівні циркулюючого Д-димеру збільшені у пацієнтів з коронарною артеріальною хворобою, гострими ішемічними подіями, включаючи інфаркт міокарда та нестабільну стенокардію. У пацієнтів з грудним болем підвищений рівень Д-димеру є раннім маркером ішемії коронарних артерій та незалежним прогностичним фактором інфаркту міокарда (37). У дослідженні 18 біомаркерів ризику ішемічної хвороби серця в когорті з більш ніж 27 000 жінок у період менопаузи, лише рівень Д-димеру був значно збільшений і був незалежним від інших маркерів фактором ризику (38). У роботі Marcucci R. та ін. (39) було показано, що вміст Д-димерів достовірно вищий у хворих IV-го функціонального класу хронічної серцевої недостатності (ХСН) порівняно з хворими на II-м і III-м функціональними класами. У цьому дослідженні, в якому включено 214 пацієнтів з II - IV функціональними класами, переконливо доведено, що підвищення Д-димерів є значним предиктором смертності при ХСН.

5. Рівень Д-димер при вагітності.

У вагітних жінок внаслідок активації синтезу плазмових гемостатичних факторів у печінці навіть у нормі спостерігається помірна тромбофілічна ситуація. До моменту пологів рівень Д-димер може перевищувати вихідний в 3-4 рази (40) (Табл.3).

Табл.3. Рівні Д-димеру у плазмі при нормальній вагітності

Зрушення параметрів гемостазу досягають максимуму в 3-му триместрі вагітності, що має фізіологічне значення та спрямоване на зменшення крововтрати під час пологів. Позитивні результати Д-димера в пізні терміни вагітності значно ускладнюють оцінку ризику та діагностику ТГВ і особливо ТЕЛА. Значне (у 5-10 разів) підвищення рівня Д-димеру спостерігається при патологіях вагітності (невиношування, гестоз, передчасне відшарування плаценти). Це призводить до призначення додаткових діагностичних процедур. У таких випадках особливого значення набувають спільне використання УЗД та аналіз на Д-димер. Рівень cut-off (порогового значення) Д-димеру щодо ризику венозного тромбоемболізму у вагітних жінок у 3-му триместрі виявляється істотно вищим.

6. Оцінка ризику тромбоемболії за інших захворювань.

Підвищені рівні Д-димеру спостерігаються при таких захворюваннях як доброякісні та злоякісні пухлини, інфекції, травми, ішемія, кровотечі або тромбози. Для багатьох з цих патологій дослідники намагалися використовувати рівні Д-димера як діагностичного та прогностичного тесту. Наприклад, рівні Д-димеру вивчали як фактори несприятливого прогнозу та/або ризику у пацієнтів зі злоякісними пухлинами, шлунково-кишковими кровотечами та некрозом, внутрішньомозковим крововиливом, серповидно-клітинною хворобою, мігрень при сильних головних болях, травмах астмі та багатьох інших хворобах. З усіх цих захворювань найбільший інтерес викликав рак. Загалом, ризик венозного тромбозу хворих на рак досягає 7% через протромботичний ефект злоякісних новоутворень та пов'язаних з цим факторів ризику, таких як іммобілізація, дія лікарських препаратів та хірургічне втручання (41,42). У той же час підвищений рівень Д-димеру у пацієнтів з раком обмежує діагностичну цінність результату, якщо він використовується лише сам по собі. Численні дослідження показали несприятливе прогностичне значення підвищених рівнів Д-димеру у плазмі у хворих на рак грудей, товстої кишки, легень, яєчників, передміхурової залози та інших органів (43-52).

Висновок.

Д-димер є надійним та чутливим тестом процесу тромбоутворення, а збільшення його вмісту у плазмі крові вказує на наявність тромбів. У клінічній практиці Д-димер використовується як маркер здатності організму до гіперкоагуляції та ендогенного фібринолізу. Негативний тест на Д-димер має негативне прогностичне значення для хворих з ТГВ і ТЕЛА. Даний тест використовується для моніторингу антикоагулянтної терапії і є чутливим маркером при діагностиці ДВЗ-синдрому. Є доцільність призначати визначення Д-димер під час вагітності для виключення діагнозу ТГВ. Д-димер відіграє істотну роль як один із потенційних чинників ризику розвитку ішемічної хвороби серця. Тому Д-димер можна розглядати як один із найцінніших лабораторних тестів для діагностики та моніторингу станів, пов'язаних із тромбозом.

Статтю підготував кандидат біологічних наук Мельник Олександр Олександрович